Экстракорпоральное Оплодотворение (ЭКО). В пробирке

Что такое ЭКО | Лечение бесплодия, как сделать экстракорпоральное оплодотворение

Не секрет, что многие семейные пары в наши дни сталкиваются с теми или иными сложностями при попытке зачать ребенка. Бесплодие – диагноз, который ставят супругам, если в течение года регулярной половой жизни без применения контрацептивов беременность так и не наступила.

К счастью, современная медицина располагает обширным арсеналом средств для победы над этим заболеванием. Семьям, которые не могут обрести желанного малыша, приходят на помощь вспомогательные репродуктивные технологии. А самой эффективной из них является процедура экстракорпорального оплодотворения. Именно эта методика признана ВОЗ наиболее результативной при лечении различных форм женского и мужского бесплодия.

ЭКО – что это такое?

«Вам может помочь только ЭКО», - говорит женщине врач-гинеколог на очередном осмотре. Однако многие семейные пары не имеют представления о том, в чем состоит метод экстракорпорального оплодотворения, насколько он безопасен для здоровья, где и каким образом проводят процедуру.

Для начала – узнаем, как расшифровать эти три буквы. Собственно, в названии заключена и сама сущность метода. ЭКО – Экстра (от лат. extra – вне, снаружи) Корпоральное (от лат. corpus – тело) Оплодотворение. То есть – зачатие вне тела женщины, соединение сперматозоида и яйцеклетки in vitro, «в пробирке».

Во многих случаях причиной бесплодия является физическая невозможность встречи женской и мужской половых клеток «в естественной среде», то есть в половых путях женщины (например, так называемый трубный фактор бесплодия – патология маточных труб, при которой они становятся непроходимыми для ооцитов). При этом женщина вполне способна выносить и родить ребенка. Следовательно, перед врачами стоит задача «организовать свидание» яйцеклетки со сперматозоидом, а получившийся эмбрион вернуть на его «законное место» - в матку будущей мамы, где беременность после ЭКО будет развиваться самым обычным путем.

Следует сразу отметить тот факт, что дети ЭКО, «дети из пробирки» ничем не отличаются от обычных детей, зачатых естественным способом. Не следует бояться, что способ зачатия in vitro каким-либо негативным образом отразится на здоровье и развитии будущего малыша.

Как делают ЭКО

Итак, для того, чтобы родить ребенка, семейной паре показано ЭКО. Процедура осуществляется в несколько этапов. Конечно, как и многие лечебные воздействия, некоторые из них не слишком физически приятны – но ничего страшного в них нет. Как правило, все этапы процедуры проводятся амбулаторно – то есть, после них не надо оставаться в клинике, а можно отправляться домой.

1.Подготовка к ЭКО. Стимуляция овуляции

Для успешного проведения процедуры экстракорпорального оплодотворения, как правило, нужно получить несколько зрелых яйцеклеток. Это достигается путем гормональной стимуляции организма женщины. Схему лечения, вид и дозировки препаратов разрабатывает врач – на основании тщательного анализа данных анамнеза пациентки и результатов обследований. Протокол ЭКО может быть «короткий» или «длинный» - это зависит от состояния организма каждой конкретной женщины и подбирается индивидуально. Цель гормональной стимуляции – во-первых, получение пригодных к зачатию ооцитов, во-вторых – подготовка эндометрия матки к приему зародыша. Весь процесс идет под постоянным УЗИ-контролем.

2. Пункция фолликулов

Как только фолликулы созрели «до готовности», наступает следующий этап подготовки к ЭКО – извлечение фолликулов. Как правило, эту процедуру проводят трансвагинально (через влагалище под контролем УЗИ). Полученные ооциты помещают в специальную питательную среду, где они ждут встречи со сперматозоидами. В свою очередь, сперма (ее следует сдавать мужу параллельно с получением ооцитов у жены) также подвергается подготовительной обработке.

3. Оплодотворение ЭКО

Свершилось! Яйцеклетки и сперму помещают в «пробирку», где и происходит долгожданное зачатие. Затем оплодотворенные яйцеклетки помещаются в инкубатор. Весь процесс проходит в специально оборудованной лаборатории под контролем специалистов-эмбриологов. Они следят за тем, как развиваются эмбрионы, нет ли у них каких-либо нарушений.

Как правило, развитие эмбрионов «в пробирке» продолжается на протяжении от 2 до 5 суток. Далее, на том этапе, когда эмбрион готов имплантироваться в матку, производится перенос.

4.Перенос эмбриона и беременность после ЭКО

Собственно перенос эмбриона осуществляется на 3-5 сутки после оплодотворения. В матку эмбрионы попадают при помощи тонкого катетера. Это абсолютно безболезненно, и не вредит ни матери, ни будущему малышу.

По современным стандартам переносится, как правило, не более двух эмбрионов. Это снижает риск наступления многоплодной беременности. Остальные эмбрионы подвергаются криоконсервации.

После этого женщине назначается поддерживающая гормональная терапия – для успешной имплантации эмбриона. Беременность определяется через две недели при помощи анализа крови на ХГЧ – хорионический гонадотропин человека.

Далее, если беременность наступила, то она развивается самым обычным путем – и через положенный срок на свет появляется новый человек.

Конечно, надо иметь в виду, что беременность с первой попытки наступает далеко не всегда. Но не следует впадать в отчаяние. Процедура экстракорпорального оплодотворения – процесс непростой. Как показывает практика, лучшее ЭКО – это не всегда первое по счету. Известны случаи, когда беременность после зачатия in vitro наступала с четвертой и даже с десятой попытки!

На нашем сайте вы сможете подробно ознакомиться со всеми аспектами сложного процесса экстракорпорального оплодотворения. Также вы сможете узнать о клиниках и медицинских центрах, где проводится лечение бесплодия с помощью ВРТ. Все в подробностях - до малейших деталей, которые будут для вас значимы, если вы собираетесь стать родителями, используя метод - экстракорпоральное оплодотворение.

Мы надеемся, что предоставленная информация поможет вам сделать правильный выбор, даст возможность разобраться, какая схема, программа – экстракорпоральное оплодотворение, или какой-либо другой метод лечения бесплодия подходит именно вам, прибавит вам веру в собственные силы, в то, что у вас все получится на пути к долгожданному материнству и отцовству.

www.probirka.org

В пробирке - это... Что такое В пробирке?

Экстракорпоральное оплодотворение или зачатие в "пробирке" — Название этой медицинской технологии происходит от двух латинских слов extra – снаружи и corpus – тело. Экстракорпоральное оплодотворение, сокращенно ЭКО, впервые в истории человечества было проведено в 1978 г. в небольшом городе… … Энциклопедия ньюсмейкеров

В Пробирке (In Vitro) (Латинск.) — данный термин используется для описания биологического процесса, происходящего вне живого организма (обычно в пробирке). Источник: Медицинский словарь … Медицинские термины

В ПРОБИРКЕ — (in vitro) (латинск.) данный термин используется для описания биологического процесса, происходящего вне живого организма (обычно в пробирке) … Толковый словарь по медицине

в пробирке — in vitro statusas T sritis Standartizacija ir metrologija apibrėžtis Bandymas, atliekamas ne gyvojoje, bet dirbtinėje sistemoje. kilmė lot. stikliniame indelyje, t. y. mėgintuvėlyje atitikmenys: angl. in vitro vok. in vitro rus. в пробирке pranc … Penkiakalbis aiškinamasis metrologijos terminų žodynas

отпечаток уровня кислоты на пробирке инклинометра — — [http://slovarionline.ru/anglo russkiy slovar neftegazovoy promyishlennosti/] Тематики нефтегазовая промышленность EN line of etch … Справочник технического переводчика

получение следа уровня кислоты на стеклянной пробирке инклинометра — — [http://slovarionline.ru/anglo russkiy slovar neftegazovoy promyishlennosti/] Тематики нефтегазовая промышленность EN etching … Справочник технического переводчика

реакция агглютинации в пробирке — — [Англо русский глоссарий основных терминов по вакцинологии и иммунизации. Всемирная организация здравоохранения, 2009 г.] Тематики вакцинология, иммунизация EN tube agglutination test … Справочник технического переводчика

Растворить в пробирке — кого. Студ. (хим.). Расправиться с кем л. (Запись 2002 г.) … Большой словарь русских поговорок

Мясо из пробирки — Мясо из пробирки, также известное как культивируемое мясо или искусственное мясо это мясо, которое никогда не было частью живущего, полноценного животного. В нескольких современных исследовательских проектах пытаются выращивать мясо в пробирке… … Википедия

КРОВЬ — КРОВЬ, жидкость, заполняющая артерии, вены и капиляры организма и состоящая из прозрачной бледножелтоват. цвета плаз мы и взвешенных в ней форменных элементов: красных кровяных телец, или эритроцитов, белых, или лейкоцитов, и кровяных бляшек, или … Большая медицинская энциклопедия

МОЧА — (урина, urina), жидкость, отде ляемая почками и выделяемая из организ ма наружу через систему мочевыводящих путей. СМ. удаляются из организма почти все азотистые продукты обмена веществ (за исключением небольших количеств, поступающих в пот и в… … Большая медицинская энциклопедия

dic.academic.ru

В ПРОБИРКЕ — с русского

translate.academic.ru

Эволюция в пробирке — Naked Science

Эволюция началась четверть века назад. В 1988-м мичиганский биолог Ричард Ленски (Richard Lenski) начал беспрецедентный «Долговременный проект по экспериментальной эволюции» (Long-term Experimental Evolution Project, или просто LTEE). Длительный по времени и в пространстве эксперимент ограничивается дюжиной колб, в которых растут кишечные палочки Escherichia coli, потомки одной-единственной бактерии-«праматери».

С того времени и до сих пор каждый день бактерии пересаживаются в свежую питательную среду для продолжения активного роста. Здесь содержится лишь необходимый минимум нужных веществ, прежде всего ? глюкоза, являющаяся основным питательным субстратом для кишечных палочек. Каждые 75 дней (примерно 500 поколений) часть бактериальной культуры отбирается, оценивается ее среднее генетическое расхождение с исходной популяцией, и образец сохраняется в заморозке для будущих исследований.

Ученые почти не вмешиваются в происходящее, позволяя работать трем ключевым инструментам эволюции: случаю, времени и смерти. За 25 лет в каждой из 12-ти популяций сменилось уже более 58 тыс. поколений ? десятки тысяч поколений отделяют и нас от древнейших представителей рода Homo.

Памятная грамота, выпущенная группой Ричарда Ленски к появлению в эксперименте 50-тысячного поколения бактерий.©Richard E. Lenski. Michigan State University

Все популяции бактерий стали разными: в каждой из них первоначальный штамм Bc251 многократно менялся, накапливал мутации, адаптировался и породил тысячи новых штаммов. Сам Ленски по ходу дела опубликовал десятки статей, последняя из которых вышла в середине этого месяца в журнале Science.

Долгое время развитие всех 12-ти популяций протекало параллельными путями. Все они благодаря адаптации к условиям клетки понемногу все более увеличивались в размерах. Но примерно на 31500-м поколении начались странности: бактерии в одной из колб стали размножаться в десятки раз успешнее всех остальных. Жидкая питательная среда стала отчетливо мутной: как установили ученые, этот штамм приобрел совершенно новую «сверхспособность» ? возможность усваивать цитрат натрия.

В питательной среде цитрата имелось предостаточно, в 20 раз больше глюкозы, но E. coli использовать его неспособны. В микробиологии эта их особенность иногда даже используется для отделения кишечной палочки от других бактерий. А вот мутировавший штамм Cit+ набросился на новый источник пищи с жадностью, быстро увеличив свою численность. «Это самое значительное эволюционное изменение, которое мы наблюдали до настоящего момента в своем эксперименте, ? сказал тогда Ленски. ?Оно, фактически, переходит границы E. coli как вида».

Ученый подсчитал, что к этому времени в его пробирках сменилось так много бактерий, что все возможные одиночные мутации уже должны были появиться в них по нескольку раз. Однако способность усваивать цитрат натрия проявилась лишь однажды ? значит, родилась она не из простой одиночной мутации, а в результате какого-то более сложного и маловероятного изменения ДНК. Это могли быть либо несколько одиночных мутаций, либо более редкая и масштабная перестройка бактериальной хромосомы.

Тогда ученый достал из холодильника замороженные клетки предыдущих поколений ? бактерии вообще легко переносят заморозку, и даже спустя многие годы замороженную культуру можно высадить на питательную среду, и она тут же пустится в рост. Эти образцы, отбиравшиеся, напомним, примерно каждые 500 поколений, позволили как бы «сохранить игру» на каждом шаге экспериментальной эволюции, и при необходимости проиграть ее снова, следя за тем, как она развивалась на каждом этапе. Вопрос был простой: появятся ли снова бактерии Cit+?

Сколько Ленски ни пытался, способность усваивать цитрат обретали клетки одной и той же популяции, причем начиная примерно с 20-тысячного поколения. Ученый понял, что именно на этом этапе произошло первое ключевое изменение, которое примерно 15 тысяч поколений спустя привело к Cit+. Эта мутация могла долгое время оставаться нейтральной, не влияя серьезно ни на один из процессов жизнедеятельности клетки, пока не появились новые мутации, которые сделали ее полезной.

В 2012-м году ученые опубликовали результаты анализа геномов бактерий Cit+ и 28-ми предыдущих поколений этой популяции. На этой основе они реконструировали всю эволюцию этого штамма, разбив ее на три «эпохи», сменяющие одна другую примерно каждые 20 тыс. поколений. Были выделены три конкретные мутации, которые шаг за шагом привели к появлению Cit+, сделав клеточную мембрану кишечной палочки проницаемой для молекул цитрата натрия.

25-летие эксперимента отметили 24 февраля 2013 года.©Richard E. Lenski. Michigan State University

Авторы заключили, что развитие Cit+ можно рассматривать как модель для развития и других сложных новых способностей в ходе эволюции. Все начинается с первой стадии – «потенцирующей», на которой накапливаются пока не играющие никакой особенной роли мутации. Затем следует «стадия актуализации», на которой появляется новая способность. Наконец, на третьем этапе эта способность совершенствуется новыми изменениями.

Впрочем, главный вывод, который можно сделать из истории штамма Cit+, состоит в том, что эволюционные процессы не всегда способны принести оптимальный результат. В 11-ти колбах E. coli так и не обрели способность питаться новым обильным ресурсом, и только в одной из них несколько совпавших случайностей открыли перед бактериями эту перспективную новую возможность.

Кроме того, ученые заметили, что в течение первых 10 тыс. поколений бактерии понемногу все более адаптировались к условиям существования и достигли некоторого максимального уровня приспособленности, после чего этот процесс, казалось, совсем остановился. Но это оказалось лишь видимостью.

Прямые эксперименты показали, что если поставить представителей разных поколений в условия прямой конкуренции, более поздние поколения всегда будут одерживать верх над более ранними. Значит, совершенствование приспособленности не прекращается никогда, хотя и сильно замедляется со временем, по мере того, как организм становится все лучше адаптирован к имеющимся условиям. «Даже если мы экстраполируем к 2,5-миллиардному поколению, ? говорит Ленски, ?они все еще будут продолжать эволюционировать и приспосабливаться».

Эволюция не останавливается и в естественных условиях, причем здесь, в изменчивой и непредсказуемой среде она протекает гораздо быстрее и динамичнее. Наглядным примером тому служит появление новых штаммов бактерий и популяций насекомых, устойчивых к антибиотикам и инсектицидам. Поразительную эволюционную гибкость демонстрируют многие вирусы, например, грипп или ВИЧ, которые до сих пор умудряются держаться на шаг впереди медиков, занятых разработкой вакцин.

Как видно, мы сами во многом подстегиваем адаптацию этих неприятных существ ? и это тот случай, когда эволюция работает против нас, и работает весьма активно. Чтобы понять, как обуздать эту живую силу, нам придется лучше понять все многообразные механизмы ее действия, а значит, несложный, но поучительный эксперимент Ричарда Ленски может сослужить человечеству огромную службу.

naked-science.ru

Как это было: история первого ребенка «из пробирки»

Наткнулся в интернете на очень интересную статью, посвященную появлению на свет в 1978 году Луизы Браун, первого ребенка – «ЭКОшки». С удовольствием предлагаю ее вашему вниманию

В июле 1978 года врачи родильного отделения клиники в Олдеме работали в экстремальных условиях. Под окнами медицинского учреждения сновали сотни репортеров, ожидавших мировой сенсации.

Гинеколог Патрик Стептоу, всерьез опасавшийся, что из-за газетчиков все пойдет не по плану, применил «военную хитрость». В решающий день мужа пациентки, к которой проявляли интерес журналисты, отправили домой. Пресса несколько расслабилась, посчитав, что роды, видимо, состоятся позже.

Но несколько часов спустя Джон Браун вернулся в клинику, будучи незамеченным. А в 23 часа 47 минут 25 июля 1978 года его жена Лесли в результате кесарева сечения произвела на свет девочку. Вполне здоровую малышку весом 2,61 кг назвали Луиза.

Для родителей она была долгожданным ребенком. Для медиков — огромной научной победой. А для религиозных фанатиков — порождением ада и покушением на самого господа Бога.

Зачатие extra: как ученые «покусились на святое»

Еще в 1940-х годах ученый начали проводить эксперименты по оплодотворению яйцеклеток человека вне организма. К началу 1960-х годов сразу несколько групп ученых в разных странах мира приблизились к теоретическому обоснованию возможности оплодотворения женской яйцеклетки, извлеченной из организма женщины, с последующим перенесением ее в полость матки для дальнейшего развития.

Экстракорпоральное оплодотворение (от лат. extra — снаружи, вне и лат. corpus — тело) должно было позволить бесплодным парам, лишенным возможности завести детей, обрести счастье.

Но не то что практическое применение ЭКО, а даже эксперименты подобного рода принимались религиозными деятелями в штыки. Наиболее радикальным служителям веры мерещился Антихрист, появляющийся на свет в результате манипуляций врачей.

Несмотря на не самую благожелательную атмосферу, ученые продолжали исследования.

В 1973 году группа по ЭКО при университете Монаш в Австралии, которую возглавлял доктор Карл Вуд, сумела создать первую беременность посредством искусственного оплодотворения. Увы, через несколько дней яйцеклетка была отторгнута из матки матери естественным путём. Но ученые не думали сдаваться.

В Великобритании над технологией ЭКО работала группа во главе с физиологом Робертом Эдвардсом и гинекологом Патриком Стептоу.

В 1977 году на прием к доктору Стептоу пришла отчаявшаяся женщина по имени Лесли Браун. Девять лет они с мужем Джоном пытались завести ребенка, но ничего не выходило. Фаллопиевы трубы женщины были блокированы, и гинекологи вынесли вердикт — бесплодие неизлечимо.

Лесли готова была отпустить мужа, чтобы он обрел счастье с другой женщиной, но Джон не покинул жену.

Патрик Стептоу, осмотрев женщину и получив результаты анализов, пригласил к себе обоих супругов, и сказал: методика, которая может им помочь, существует, но на сегодняшний день она является экспериментальной.

Ученый умолчал о том, что еще никому не удавалось при помощи ЭКО произвести на свет младенца.

Супруги Браун дали свое согласие, и эксперимент начался.

По секрету всему свету

Много лет спустя Луиза Джой Браун в интервью не без юмора замечала, что «ребенком из пробирки» ее называть неправильно — «таинство зачатия» происходило в так называемой чашке Петри.

Как бы то ни было, но оплодотворенная яйцеклетка была помещена в матку Лесли, и медики стали напряженно следить за происходящим.

Неделя шла за неделей, месяц за месяцем, и стало ясно — беременность протекает нормально. Эдвардс и Стептоу старались не разглашать секрета, боясь спугнуть удачу, но когда Лесли была на шестом месяце, информация все-таки просочилась в прессу.

Хотя медики и прятали миссис Браун под вымышленным именем, ее быстро вычислили. Чтобы хоть как-то снизить ажиотаж, супруги Браун подписали договор с одним из таблоидов, рассчитывая, что получив эксклюзивное право на освещение истории, журналисты издания прикроют их от своих коллег-конкурентов.

«Ребята спрашивали, как мне было там, в пробирке»

Когда Луиза появилась на свет, она была обречена на повышенное внимание к своей персоне. Ее жаждали наблюдать медики, за ней следила пресса, и, что гораздо хуже, вокруг нее вились экзальтированные верующие.

Впрочем, последние вскоре успокоились — ни шестерок на лбу, ни рогов и копыт у Луизы не было. Она вообще ничем не отличалась от сверстников. Когда ей было четыре, папа с мамой рассказали девочке о том, как она появилась на свет.

«Мама и папа показали мне видео с записью, как я родилась, попытались что возможно объяснить, когда мне было четыре года. Я думаю, они это сделали на тот случай, если о моем происхождении узнают дети в школе, а ведь они могут быть весьма жестокими... Ребята, например, спрашивали, как мне было там, в пробирке, или что-то в этом роде», — вспоминала Луиза.

Натали

Эдвардс и Стептоу получили признание далеко не сразу. Их обвиняли во всех смертных грехах и коллеги, и власти, и новые эксперименты по ЭКО приходилось проводить полусекретно.

Патрик Стептоу был поражен, когда на очередном приеме увидел перед собой... Лесли Браун.

«Доктор, я хочу еще ребенка», — заявила она.

В 1982 году Лесли родила вторую дочь, которую назвали Натали.

Натали Браун вошла в историю семнадцать лет спустя, в 1999 году. Она стала первым «ребенком из пробирки», который естественным путем зачал и родил собственного ребенка — дочь Кэйси.

Луиза отстала от Натали на семь лет. В 2006 году она родила сына, которого родители назвали Кэмерон. В 2013 году в семье Луизы появился второй сын, который получил Эйден Патрик Роберт. Частью имени мальчика стали имена Патрика Стептоу и Роберта Эдвардса, ученых, без которых Луиза Браун никогда бы не появилась на свет.

www.probirka.org

Эволюция в пробирке // Александр Власов ≪ Scisne?

Давняя мечта химиков и биологов — научиться создавать молекулы с определёнными заданными свойствами, которые могли бы стать основой молекулярных устройств или новых материалов с нужной биологической активностью.

До недавних пор основным подходом к решению этой проблемы был так называемый молекулярный дизайн. Химики на основании теоретических рассуждений и экспериментальных фактов пытались представить, как должна быть устроена молекула, чтобы она обладала требуемыми свойствами. Затем такие молекулы синтезировали и проверяли соответствие полученного с ожидаемым.

К сожалению, предсказательная сила сегодняшних теоретических методов невысока, а сам синтез новых соединений — дело долгое и трудоёмкое. Поэтому создание новых соединений методом рационального дизайна требует синтеза и исследования большого количества разных соединений, являясь дорогим малопроизводительным способом. Кроме того, этот подход может быть применён лишь тогда, когда учёный понимает, как должна быть устроена искомая молекула, чтобы обладать требуемыми свойствами. А бывает это, к сожалению, не всегда. Как же быть в таких случаях?

От дизайна к селекции

Озадаченные необходимостью получения молекул с данными свойствами, молекулярные биологи в течение последних 15 лет пытались решать эту задачу с помощью другого подхода подхода, издавна использующегося самой Природой. Конкретнее — путём создания условий, когда начинает работать механизм молекулярной селекции, как это происходило на определённых стадиях эволюции живых систем.

Были разработаны методы получения сложных смесей разных молекул и процедуры, в результате которых из таких смесей автоматически отбирались и размножались молекулы с заданными свойствами. В результате использования этого крайне эффективного подхода неизмеримо расширились возможности учёных в области создания необычных катализаторов и молекул-рецепторов, связывающих разные химические соединения.

В основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) лежит способность фермента ДНК-полимеразы с фантастической скоростью синтезировать из мономеров-нуклеотидов комплементарные цепочки ДНК. С помощью этого фермента из одной двуцепочечной молекулы ДНК получается две её точные копии, далее — четыре, а после n циклов построений — 2n копий каждой молекулы, присутствовавшей на начальном этапе. При множественном повторении цикла «нагревание/охлаждение» имеющийся препарат ДНК можно размножить в неограниченных количествах. Обычно исследователи проводят около 30 циклов и получают астрономическую цифру 230 копий.

Сейчас комбинаторные методы широко используются химиками-органиками: синтезируются «библиотеки» органических соединений различной структуры, и затем с помощью физико-химических методов из них «вылавливается» то, что нужно. Но задача эта не так проста, как кажется, поскольку из огромного количества полученных молекул нужно идентифицировать и выделить лишь малую часть. Иногда — исчезающе малое количество материала… Если речь идёт о нескольких молекулах из миллиардов, то никакими обычными химическими методами выделить и охарактеризовать их невозможно — если только не иметь возможности размножить их после выделения. Поэтому химики так завидуют молекулярным биологам, которые умеют неограниченно размножать молекулы из своих библиотек, построенных из нуклеиновых кислот, с помощью замечательного процесса — полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Суть метода

Открытый в 1985 г. метод ПЦР, позволяющий в неограниченных количествах размножать нуклеиновые кислоты — ДНК и РНК — стал основой современной молекулярной селекции. Используя его, на конечном этапе синтеза можно получить просто астрономическое число копий каждой молекулы, присутствующей в растворе изначально.

Но первой стадией молекулярной селекции является получение пула разнообразных молекул, т. е. создание молекулярной библиотеки нуклеиновых кислот. Так учёные называют смесь молекул нуклеиновых кислот, имеющих одинаковую длину, но отличающихся последовательностью нуклеотидов. Получить их можно, если при синтезе нуклеиновой кислоты на специальном автоматическом синтезаторе добавлять на каждой стадии сразу все четыре мономера (А, Т, G, С). Следует отметить, что к каждой молекуле добавляются фланкирующие (концевые) участки определённой последовательности, позволяющие в дальнейшем проводить ПЦР.

В молекулярной селекции обычно используются молекулы с «длиной» в 30–80 нуклеотидов. То есть получаемая в результате синтеза полная библиотека будет содержать весь набор возможных последовательностей; от 430 до 480 — около 1048 разных молекул! А поскольку в зависимости от последовательности нуклеотидов нуклеиновые кислоты могут сворачиваться самыми разными способами, то получаются смеси, содержащие огромное структурное разнообразие молекул. На селекционный отбор даже невозможно взять всю библиотеку; обычно используют лишь «малую» часть — «всего» 1015 молекул, с которыми реально можно работать.

в наши дни существуют специальные ПЦР-машины, способные быстро менять температуру по заданной программе в циклическом режиме и одновременно работать с десятками образцов

На заре открытия ПЦР процесс этот для исследователя был не из лёгких — приходилось постоянно бегать с пробирками в руках между тремя термостатами. К счастью, в наши дни существуют специальные ПЦР-машины, способные быстро менять температуру по заданной программе в циклическом режиме и одновременно работать с десятками образцов. Теперь исследователю достаточно только поставить пробирки и нажать кнопку. Фото автора.

Синтезируют обычно молекулы ДНК (поскольку это дешевле и эффективнее, чем синтез РНК), на которых сразу можно проводить селекционный отбор. Но поскольку РНК обладает более широким репертуаром возможностей, чем ДНК, то с синтезированной ДНК при желании с помощью фермента РНК-полимераза можно считать РНК-копию и провести отбор по сходной схеме.

Что захочешь — то и получишь!

Сам процесс отбора искомых молекул начинается с того, что полученную молекулярную библиотеку наносят на колонку, где находится какое-то вещество, с которым и должны связываться эти молекулы. В результате проведённой селекции выбираются определённые молекулы — конечно, из тех, что присутствовали в исходной смеси, сложность которой ограничена по очевидным физическим причинам. Однако относительно простая модификация схемы эксперимента позволяет использовать мощный естественный фактор, благодаря которому процедура отбора молекул превращается в процесс, аналогичный эволюции природных живых систем.

Дело в том, что в процессе размножения молекул ДНК копирующие ферменты можно заставить немного «ошибаться». При этом в отобранные молекулы вносятся мутации, и конечный набор молекул становится несколько отличным от исходного — полная аналогия природному процессу. За счёт некоторых мутаций могут получаться молекулы с более подходящими свойствами, которые, естественно, и будут накапливаться в смеси при повторении этапов отбора. Настоящая мини-эволюция в пробирке!

Пространственная структура двуцепочечной молекулы РНК

По окончании отбора нужно установить нуклеотидные последовательности молекул-чемпионов, для чего их индивидуально тестируют и изучают. Весь процесс от начала до конца занимает несколько недель, в случае его автоматизации — дни. В результате селекции можно получить так называемые РНК-аптамеры, связывающие определённые молекулы (от латинского слова aptus — подходить), или рибозимы (слово образовано слиянием слов «рибонуклеиновая кислота» и «энзим», белковый фермент), катализирующие определённые реакции.

Между прочим, первая реакция при взгляде на формулы нукдеотидов недоверие. Недоумеваешь, как из таких молекул можно получить катализаторы — в них ведь совсем нет удобных для катализа групп! Тем не менее за счёт подбора определённой, удачной пространственной молекулярной структуры РНК-катализаторы ухитряются достигать выдающейся эффективности даже при относительно небольшой длине в 30–80 нукдеотидов. Приходится только удивляться могуществу дарвиновской эволюции, работающей даже на молекулярном уровне.

Уникальность и сила метода молекулярной селекции состоит в простоте. Нам не требуется абсолютно никаких предварительных знаний ни о молекуле, которую требуется отобрать, ни о механизме самого процесса распознавания. Мы просто используем заранее разработанную универсальную схему, и такой простой метод «грубой силы» незамедлительно даёт прекрасные результаты.

При этом можно отобрать нe только аптамеры или рибозимы, но и молекулы с любыми другими свойствами, главное — придумать саму процедуру отбора этих молекул. Метод молекулярной селекции очень эффективен благодаря высокой скорости, достигаемой за счёт параллельности процессов и огромного количества одновременно тестируемых молекул.

«Практичные» рибозимы и аптамеры

За пятнадцать лет с момента изобретения метода молекулярной селекции в лабораториях было отобрано множество рибозимов, катализирующих различные реакции и имеющих реальное практическое применение. Среди них есть рибозимы, осуществляющие реакцию аминоацилирования РНК, формирование амидной, пептидной и гликозидной связей, алкилирование РНК, фосфорилирование, полимеризацию и многое другое.

Первый этап процесса молекулярной селекции — нанесение молекул РНК из молекулярной библиотеки на колонку. Лишь несколько молекул РНК с подходящей структурой свяжется с колонкой, в то время как подавляющее большинство молекул не взаимодействует с ней. После отмыва колонки связанную фракцию далее «снимают», переводят в форму ДНК с помощью фермента обратная транскриптаза и размножают методом ПЦР. Получается новая библиотека (пул) молекул, которые будут связываться с колонкой гораздо лучше. Поскольку мир не идеален, одного цикла селекции не бывает достаточно из-за неполного удаления различных неспецифических РНК. Обычно требуется около 10 циклов, чтобы отобрать несколько уникальных последовательностей из 1015 кандидатов.

Пожалуй, наибольший интерес из всех вызвали рибозимы, способные расщеплять молекулы РНК. Подобные рибозимы широко распространены в природе, но благодаря молекулярной селекции удалось отобрать гораздо более эффективные РНК-и ДНК-катализаторы.

Молекулы эти состоят из определённых {фланкирующих) нуклеотидных последовательностей, специфично связывающихся с РНК-мишенью, и каталитической части, вызывающей расщепление мишени. Каждый рибозим способен таким образом «уничтожить» множество молекул-мишеней. Очевидное применение этих молекул — использование их в терапевтических целях: для расщепления вирусных РНК либо «излишних» РНК, т. е. тех РНК, которые организм производит в избыточном количестве в случае некоторых заболеваний. Ряд подобных препаратов находится на данный момент на стадии клинических испытаний, в том числе — использующийся для терапии рака «Херзим» (Herzyme), направленный против человеческого фактора роста эпидермиса (Her2).

С помощью метода молекулярной селекции были отобраны и тысячи аптамеров, образующие специфические комплексы с самыми различными органическими соединениями и биологическими молекулами, включая факторы роста, ферменты, антитела, рецепторы, вирусные белки. Можно даже получить аптамеры на весь организм — например, на определённую бактерию, которые будут связываться с её различными поверхностными структурами. И многие из таких аптамеров были получены как раз для решения практических задач.

По механизму действия аптамеры очень напоминают антитела — белки, которые нарабатывает наша иммунная система для распознавания и борьбы с чужеродными веществами, попавшими в кровоток. Однако аптамеры обладают рядом уникальных свойств, что даёт им некоторые преимущества перед антителами. Так, моноклональные антитела получают в живом организме или в тканевой культуре. Аптамеры же получают селекцией в пробирке, а далее выявленные последовательности синтезируют искусственно, что гораздо быстрее, дешевле и проще. К тому же благодаря химическому синтезу всегда гарантирована чёткая безошибочная последовательность и качество.

Можно создать аптамеры, связывающиеся с любыми веществами, тогда как антитела можно наработать только на довольно узкий круг веществ, нетоксичных для организма. Аптамеры же получают контролируемым способом — поэтому в процессе можно использовать любую концентрацию соли, любую кислотность, температуру и т. д. К тому же аптамеры нетоксичны, не вызывают аллергии, их можно модифицировать введением дополнительных химических группировок, при этом они стабильны при хранении.

Необычные лекарства

Одним из наиболее известных является недавно полученный аптамер к фактору свёртывания крови IXa. Суть заключается в следующем: в клинической практике желательно, чтобы в ходе хирургической операции кровь не сворачивалась, для чего используют антикоагулянты — специальные вещества, препятствующие свёртыванию крови. Однако сразу после операции самым важным становится быстрое заживление ран. Однако антикоагулянты, способствуя успешной операции, создают затем большой послеоперационных риск из-за обильных кровотечений, которые могут привести даже к смертельному исходу. Поэтому действие такого лекарства обязательно должно сниматься специальным антидотом.

+ Формула отобранного с помощью молекулярной селекции рибозима, умеющего эффективно сшивать фрагменты РНК. На ранних стадиях эволюции — в гипотетическом «мире РНК» — подобные примитивные рибозимы могли из маленьких кусочков постепенно наращивать длинные молекулы, которые уже могли выполнять различные сложные функции.

В настоящее время в качестве антикоагулянта широко используется гепарин — поскольку он является единственным подобным веществом, для которого есть антидот, полипептид протамин. К сожалению, в использовании гепарина существует ряд ограничений, и кроме того, он токсичен.

Для расширения круга антикоагулянтных препаратов был проведен селекционный отбор. Модифицированная молекула РНК, полученная в ходе этой селекции, эффективно снижает свёртываемость крови и в отличие от гепарина нетоксична и не вызывает аллергии. Далее к этому аптамеру был синтезирован антидот так называемый антисмысловой олигонуклеотид, который мог контролировать активность антикоагулянта и за короткое время обращать действие РНК-аптамера. К настоящему моменту получено уже несколько аптамеров, которые являются кандидатами для создания нового поколения антикоагулянтов.

Продукт естественной эволюции — природный рибозим, выделенный из инфузории Tetrahymena thermophila.

Аптамеры потенциально могут найти широкое применение в клинике в качестве лекарственных препаратов. Наиболее, пожалуй, хороню изучен аптамер, направленный против везикулярного фактора роста эпителия (VEGF), который служит мишенью в терапии заболеваний сосудов. И хотя только рибозимы способны расщеплять РНК-мишень, а аптамеры лишь сверхпрочно связываются с ней, в конечном счёте эффект получается тот же: синтез «вредного» белка прекращается.

Вышеупомянутый препарат модифицированной РНК (Macugenили Pegaptanib) уже прошёл клинические испытания. Он используется для лечения макулярной дегенерации — болезни, служащей главной причиной необратимой потери зрения среди людей в возрастной группе старше 55 лет. Лекарство-аптамер вводят непосредственно в глаз пациенту, причём для улучшения состояния достаточно нескольких сеансов.

Помимо РНК- широко используются также ДНК-аптамеры. В обоих случаях для придания лечебным молекулам повышенной устойчивости к действию расщепляющих ферментов, улучшения способностей к связыванию с мишенью либо для обеспечения специфической доставки в организме в них зачастую вводятся дополнительные химические группы.

Прямое попадание

Помимо прямого воздействия на РНК-мишень, аптамеры, подобно антителам, могут доставлять небольшие органические молекулы (лекарства, токсины) прямо в определённые виды клеток. Например, при терапии раковых заболеваний аптамеры «узнают» специфические рецепторы на поверхности раковых клеток и связываются с ними, высвобождая свой смертоносный груз и таким образом специфически уничтожая эти клетки.

Аптамер к фактору свёртывания крови IXa. Антисмысловой олигонуклеотид в роли антидота способен связываться и инактивировать антикоагулянт

Аптамеры также широко используются для выявления нежелательных белков — мишеней для лекарственного воздействия — благодаря своей способности специфически и прочно связываться с молекулами и инактивировать их. Ведь подавляющее большинство лекарственных препаратов основано на малых органических молекулах, и для эффективной терапии заболевания с их помощью в первую очередь необходимо знать, уровень какого белка надо понизить, чтобы победить болезнь.

Очевидным применением аптамеров и медицине является и детекция различных молекул. Например, в некоторых случаях аптамер, специфичный к определённой молекуле, иммобилизуют (закрепляют) на поверхности пластинки. Далее на неё наносится образец. Если в образце присутствуют искомые молекулы, то они быстро связываются с аптамером.

Потом добавляют второй аптамер, который может нести, например, какую-нибудь флюоресцентную группу и который способен узнавать комплекс из первого аптамера с молекулой-мишенью. Если после отмывки пластинка светится — значит, образец содержал искомую молекулу, если же нет — она отсутствует, и весь второй аптамер был смыт с пластинки.

Схема детекции молекул с помощью аптамеров

В результате подобных процедур было показано, что с помощью аптамеров можно определять очень низкие количества иммуноглобулинов E-класса в препаратах крови, что недостижимо с помощью обычных моноклональных антител. Аптамеры могут высокоспецифично выявлять опухолевые маркёры, что даёт возможность использовать их для диагностики некоторых видов рака. Также они могут найти применение в экстренных медицинских ситуациях и в ходе военных действий, когда важно быстро определить в образцах содержание отравляющих веществ.

Новый этап — селекция белков

Несколько усложнив экспериментальные системы, молекулярным биологам удалось применить принципы и подходы молекулярной эволюции для получения уже белковых молекул с заданными свойствами. Ведь белок синтезируется в соответствии с генетическими программами, которые представляют собой нуклеотидные последовательности ДНК.

Если взять в качестве программы обычную молекулярную библиотеку последовательностей ДНК, как это делалось в селекционных экспериментах по получению аптамеров, и затем осуществить на ней синтез белка, то получится соответствующий по сложности набор белковых молекул. И если придумать способ отбора последних по функциональным свойствам и способ размножения кодирующих их ДНК-программ, то задача будет решена.

На сегодня реализовано два варианта решения проблемы. При подходе, названном «рибосомный дисплей», транслируемый белок остаётся связанным с рибосомой (клеточным элементом, который осущестляет сборку белковой молекулы) и кодирующей его матричной РНК. Этот комплекс из трёх компонентов и используют для селекционного отбора.

При селекции из белковых библиотек в случае «мРНК дисплея» белок «пришит» к соответствующей мРНК, благодаря чему можно размножить отобранные в ходе селекции молекулы.

В случае так называемого «мРНК дисплея» кодирующую белок матричную РНК транслируют и затем «пришивают» к синтезированному белку. Полученные гибридные молекулы очищают от компонентов рибосомы и используют для селекции. В результате экспериментов с использованием этих схем были получены высокоспецифичные и прочно связывающиеся пептиды, антитела и ферменты.

По пути молекулярнгой эволюции

За считанные годы с момента её изобретения молекулярная селекция нашла множественные применения в различных областях молекулярной биологии, биохимии и медицины. Спектр оказался очень широк: от фундаментальной науки (гипотеза«мира РНК») до практических применений в биотехнологиях и медицине, включая средства диагностики и лекарства. Этот «метод грубой силы», основанный на комбинаторных подходах и молекулярной селекции, всё шире используется в исследовательской практике и прикладных работах. Автоматизация процессов, использующихся в селекционных мвкриментах, и создание эффективной робототехники делают его всё более эффективным, позволяют решать всё более сложные задачи по созданию молекул с заданными свойствами.

Очевидно, следующим шагом в области молекулярной селекции будет конструирование более сложных систем, которые позволят создавать уже не просто «умные молекулы», но, например, простейшие искусственные клетки для биотехнологических целей. Ведь эволюция, как ей и положено процесс безостановочный.

Редакция благодарит к. х. н. В.В. Коваля(ИХБФМ СО РАН) за помощь в подготовке иллюстративного материала.

Об авторе:Власов Александр Валентинович — кандидат химических наук, научный сотрудник Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск).

«Наука из первых рук»

scisne.net

В ПРОБИРКЕ - это... Что такое В ПРОБИРКЕ?

medicine_dictionary.academic.ru