Содержание
Пионер CRISPR/Cas создал новый метод микроскопии. Для него не нужен микроскоп. Вместо света он использует молекулы ДНК, а вместо глаз — секвенатор и компьютер — Наука
Современные методы микроскопии хорошо определяют форму клеток и плотность расположения молекул внутри них, но не позволяют распознать отдельные молекулы. Можно, конечно, ввести в клетку специальные красители или светящиеся зонды, но для каждой интересующей ученых молекулы нужен свой зонд, желательно не перекрывающийся по спектру излучения с другими. Эти технологии работают для отдельных белков, но становятся неудобны, когда речь идет о нуклеиновых кислотах, например молекулах РНК.
РНК представляют собой копии ДНК, «выписки» из генов, глядя на которые, клетка синтезирует белки. В отличие от ДНК, которая сконцентрирована в ядре, РНК распределены по всей цитоплазме, а иногда группируются в том месте, где необходимы кодируемые ими белки. Чтобы рассмотреть расположение молекул РНК в клетке, группа Джанга Фэна (человека, который впервые заставил работать CRISPR/Cas в клетках человека) из Массачусетского технологического института создала метод ДНК-микроскопии.
Впрочем, с привычной нам микроскопией он имеет мало общего — например, для него нужен не микроскоп, а секвенатор и специальный алгоритм, который строит по данным секвенирования картинку.
Для начала интересующие нас клетки фиксируют и проделывают в мембране небольшие дырочки. В эти отверстия впрыскивают полимеразы, ферменты для копирования нуклеиновых кислот и ДНК-зонды — последовательности ДНК, комплементарные (то есть способные прилипнуть) к исследуемым молекулам РНК и несущие на конце уникальные метки.
В качестве точки отсчета — условно говоря, «нулевой координаты» — ученые использовали РНК белка актина. Этих РНК много в самых разных участках клетки, поэтому логично было ожидать, что от них можно будет дотянуться до любой точки клетки.
Впрыснутые в клетку зонды прилипают ко всем РНК, и клетка достраивает зонды до конца — для этого ей, собственно, и требуются полимеразы. Получаются нити, в которых за последовательностью РНК следует уникальная метка.
Затем в клетки вбрасывают праймеры — набор коротких уникальных кусочков ДНК. Они прилипают на концы нитей, клетка тоже достраивает их до конца. Получаются молекулы, состоящие из последовательности РНК, уникальной метки и праймера.
Описание
Ольга Скворцова / Chrdk.
Затем эти молекулы слипаются друг с другом своими концами, поскольку праймеры комплементарны. Итогом становится длинная нить: «нулевая» РНК, уникальная метка 1, слипшиеся праймеры, РНК-мишень, уникальная метка 2. Чем ближе друг к другу в клетке расположены «нулевая» РНК и РНК-мишень, тем больше получится таких нитей, и, соответственно, по их числу можно оценить расстояние между двумя фрагментами РНК.
Описание
Ольга Скворцова / Chrdk.
Наконец, исследователи секвенируют нуклеиновые нити из клетки и оценивают их концентрацию. По соотношению сцепок «нулевых» РНК с разными РНК-мишенями компьютерный алгоритм восстанавливает их распределение по клетке и даже ее форму.
Изображения, которые исследователи получили таким методом, очень напоминают результаты обычной световой микроскопии.
Описание
В — фото клеток, производящих красный и зеленый флуоресцентные белки, в обычный микроскоп. D — результат ДНК-микроскопии. Красный и зеленый — флуоресцентные белки, серый — актин, белый — белок, участвующий в расщеплении глюкозы. Weinstein et al. / Cell
Впервые получено реальное изображение ДНК // Смотрим
Впервые получено реальное изображение ДНК // Смотрим
Профиль
30 ноября 2012, 14:05
- Дарья Загорская
(иллюстрация Francesco Gentile et al.
).
).Итальянские физики с помощью просвечивающего электронного микроскопа и специально разработанного метода подготовки образцов впервые в мире получили фотографии ДНК.
В 1953 году Джеймс Уотсон и Френсис Крик установили, что структура ДНК представляет собой двойную спираль. Учёные определили это, используя данные рентгеноструктурного анализа, полученные Морисом Уилкинсом и Розалиндой Франклин.
Этот метод анализа основан на дифракции рентгеновских лучей на трёхмерной кристаллической решётке, в узлах которой в данном случае были расположены молекулы ДНК.
Дифракционная картина регистрируется на фотопластинке. В случае ДНК выходное изображение представляет собой сложнейшую комбинацию точек, положение которых определяется расположением атомов в молекуле. «Расшифровка» такого изображения требует сложного математического подхода.
Получаемые данные позволяют определить местоположение атомов, межатомные расстояния, общую структуру молекул и многое другое. Но как бы точны ни были расчётные модели, они всё равно дают лишь теоретическое представление об объекте исследования.
Учёные из Итальянского технологического института (IIT) решили изменить ситуацию и сфотографировать ДНК напрямую. С помощью электронного микроскопа они запечатлели знаменитую двойную спираль во всём её великолепии на фотографии, что стало возможным благодаря своеобразному трюку.
Энзо Ди Фабрицио (Enzo Di Fabrizio) и его коллеги разработали уникальный метод нанесения образца, который позволил сделать заветную фотографию просвечивающим электронным микроскопом.
Учёные создали кремниевую подложку с наноразмерными столбиками из кремния, которые обладают водоотталкивающими свойствами. В результате при нанесении влага из раствора с ДНК чрезвычайно быстро испаряется, оставляя молекулы растянутыми и полностью готовыми к «просмотру».
Помимо этого исследователи снабдили подложку множеством крошечных отверстий, через которые проникают пучки электронов. Это позволило получить изображение с высоким разрешением.
Все старания учёных окупились сторицей: на снимке перед ними предстала нить из двойных спиралей ДНК, напоминающая штопор с очень плотными витками. (К сожалению, на настоящий момент учёные имеют возможность работать лишь с «канатами» из ДНК, которые состоят из шести молекул, закрученных вокруг седьмой. Причина в слишком большой энергии электронов, используемых микроскопом, поток частиц мгновенно разрушит одиночную двойную спираль.)
Итальянцы надеются, что вскоре новая технология исследования поможет рассмотреть, каким образом ДНК взаимодействует с другими биологически активными молекулами, например, с белками и РНК.
Сейчас специалисты продолжают поиски более чувствительных детекторов с меньшей энергией электронов, а также совершенствуют метод подготовки образцов для анализа.
Что ж, вполне вероятно, что вскоре мы увидим и «личную» фотографию легендарной двойной спирали.
А пока с «групповым» снимком и результатами исследования можно ознакомиться в статье в журнале Nano Letters.
Также по теме:
Новый анализатор ДНК выдаёт генетический портрет преступника за 25 минут
Синтетические биологи готовятся найти ДНК на Марсе
Геном человека оказался сложнее, чем думали раньше
Нити ДНК определяют форму наночастиц золота
Детектор из золота и ДНК поможет доказать существование тёмной материи
новости
Весь эфир
Авто-геолокация
ДНК впервые получена с помощью электронного микроскопа
Жизнь
28 ноября 2012 г.
Роланд Пиз
Возможно, поэтому жизнь испорчена
(Изображение: Энцо ди Фабрицио)
Натянутый канат ДНК между двумя кремниевыми наностолбами
(Изображение: Энцо ди Фабрицио) штопор в истории. Теперь электронный микроскоп запечатлел знаменитую двойную спираль Уотсона-Крика во всей ее красе, отобразив нити ДНК, покоящиеся на силиконовом ложе из гвоздей. Этот метод позволит исследователям увидеть, как белки, РНК и другие биомолекулы взаимодействуют с ДНК.
Структура ДНК была первоначально открыта с помощью рентгеновской кристаллографии. Это связано с рассеянием рентгеновских лучей на атомах в кристаллизованных массивах ДНК с образованием сложного узора из точек на фотопленке. Интерпретация изображений требует сложной математики, чтобы выяснить, какая кристаллическая структура может привести к наблюдаемым закономерностям.
Новые изображения гораздо более очевидны, так как они представляют собой прямое изображение нитей ДНК, хотя они видны с помощью электронов, а не рентгеновских фотонов.
Уловка, использованная Энцо ди Фабрицио из Итальянского технологического института в Генуе, Италия, и его команда заключалась в том, чтобы вырвать нити ДНК из разбавленного раствора и положить их на слой наноскопических кремниевых столбиков.
Реклама
Команда разработала модель столбов, обладающих чрезвычайно водоотталкивающими свойствами, благодаря чему влага быстро испаряется, оставляя растянутые нити ДНК, готовые к просмотру. Команда также просверлила крошечные отверстия в основании наностолбика, через которые они пропускали пучки электронов, чтобы получить изображения с высоким разрешением. Результаты показывают хорошо видимую штопорную нить двойной спирали ДНК. С помощью этой техники исследователи смогут увидеть, как отдельные молекулы ДНК взаимодействуют с другими биомолекулами.
Но в настоящее время этот метод работает только с «шнурами» ДНК, состоящими из шести молекул, обернутых вокруг седьмой, выступающей в качестве ядра. Это потому, что энергия электронов достаточно высока, чтобы разрушить одну молекулу ДНК.
Использование более чувствительных детекторов, способных реагировать на низкоэнергетические электроны, должно вскоре позволить команде увидеть отдельные двойные спирали и даже раскрученные одиночные нити ДНК. «Благодаря улучшенной подготовке образцов и более высокому разрешению изображений мы могли напрямую наблюдать ДНК на уровне отдельных оснований», — говорит ди Фабрицио.
Ранее в этом году команда Университетского колледжа Лондона под руководством Барта Хугенбума исследовала отдельные нити ДНК, используя технику атомно-силовой микроскопии, подобную шрифту Брайля (doi.org/jvc). Как и итальянская команда, им удалось обнаружить извилистую бороздку, которая разделяет две нити двойной спирали.
Ссылка на журнал: Nanoletters , doi.org/jt3
Еще по этим темам:
- ДНК
- биология
Люди впервые увидели структуру ДНК
История фотографии, раскрывающей геометрию, на которой основана вся жизнь
Энцо ди Фабрицио 305 S.
Немногие тайны хотя бы приближаются к загадкам жизни — откуда она берется, как воспроизводится — по своему величию. Что может быть более простым, более красивым и вызывающим более благоговейный трепет, чем двойная спираль, те переплетающиеся, извилистые нити, которые уступают место всей жизни, изображение которых мы можем увидеть впервые?
Но, конечно же, мы знали, как выглядит ДНК, еще до того, как увидели ее так непосредственно в электронный микроскоп, как на верхней фотографии, опубликованной на этой неделе.
На самом деле мы знаем о двойной спирали уже 60 лет. И это потому, что Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик видели этот рентгеновский снимок, сделанный Розалиндой Франклин в 1952 году:
Фотография 51
Есть что-то настолько ошеломляющее в том моменте, когда Уотсон впервые увидел это изображение и вдруг стал первым человеку понять структуру генетического материала.
Позже он писал:
В тот момент, когда я увидел картинку, мой рот открылся, а пульс участился. Шаблон был невероятно проще, чем те, которые были получены ранее. Кроме того, черный крест отражений, господствовавший на картине, мог возникнуть только из спиральной структуры.
Хотя на этом изображении может показаться, что вы видите небольшой фрагмент ДНК, метод рентгеновской кристаллографии, который использовал Франклин, не дает, в отличие от электронного микроскопа, изображения того, что вы увидели бы невооруженным глазом. если бы вы только могли видеть что-то такое маленькое. Скорее, как объяснила NOVA в специальном отчете 2003 года, «рентгеновские лучи могут создавать изображения мельчайших структур, таких как ДНК, потому что их длины волн настолько коротки, что рентгеновские лучи фактически отражаются от атомов. через молекулу ДНК рикошетят от молекулярных структур на своем пути и рассеиваются или дифрагируют в разных направлениях. Когда рентгеновские лучи выходят из ДНК, они оставляют после себя узор на кусочке фотопленки».